Archiv verlassen und diese Seite im Standarddesign anzeigen : Ausschluss-/Gelpermeationschromatographie: Lebensdauer der Säulen
BSchmidtB
26.07.2006, 12:25
Kann mir jemand sagen, in welchen zeitlichen Größenordnungen sich die Lebensdauer der Säulen für die Gelpermeationschromatographie bewegt?
Hat einer der Anwesenden Erfahrungen beim Einsatz mit wässrigen Systemen oder sogar bei der Analyse von Humin- und Fluviksäuren mit dieser Methode?
Guten Tag Fr. oder Herr Schmidt,
vielen Dank für Ihre Anfrage.
Ich gehe davon aus , dass die Analyse von Humin- und Fulvosäure (engl. fulvic acid) gemeint ist? ! Fluvicsäure ist mir unbekannt und ich habe auch leider keine praktische Erfahrung in der Analyse derartiger Substanzen, wohl aber mit GPC.
Während die Huminsäuren nur unter alkalischen Bedingungen in wässrigen Lösungsmitteln löslich sind, kann Fulvosäure pH-unabhängig in Wasser untersucht werden.
Eine weitere Schwierigkeit besteht darin, dass insbesondere die Huminsäuren strukturell sehr heterogen sind. An den Seitenketten der Ringsysteme können Peptide unterschiedlicher Kettenlänge hängen, die entsprechend zu verschieden grossen Molmassen führen. Dies wirft die Frage auf, ob die GPC eine ausreichende Trennkapazität besitzt um die verschiedenen Huminsäuresubtypen zu separieren?
welches Ziel wird mit der Analyse verfolgt?
Geht es also darum nur eine grobe Trennung ziwschen Fulvo- und Huminsäuren zu erreichen oder, um bei letzteren die Varianten zu identifizieren? Ist Letzteres der Fall, so würde ich die massenspektroskopische Analyse (MALDI-TOF_MS) empfehlen, welche dann allerdings kaum quantitativ möglich sein dürfte.
Die verschiedenen auf dem Markt angebotenen GPC-Materialien haben ganz unterschiedliche Lebensdauern. Sie hängen sehr stark von individuellen Faktoren ab.
Beeinflussende Faktoren sind:
- Probenvorbereitung (Filtration der Analyten vor dem Auftragen, um Aggeregatbildung zu unterbinden;
- Aufbewahrung des Säulenmaterials in organischen Lösungsmitteln, um mikrobielles Wachstum zu verhindern;
- Sorgfältiges Regenerieren falls Sedimente oder Aggregate beobachtet werden etc.;
- Häufigkeit der Benutzung und Wahl der Umgebungsparameter während der Experimente (Druck, Temperatur etc.).
- Packung in Glas-, Kunststoff- oder Metallsäulen - insbesondere bei letzteren gibt es häufig Ablagerungen (Abrieb), die die Analyten kontaminieren können.
Bei sachgerechtem Umgang mit dem Material kann es gelingen, dass das Material über 1-2 Jahre stabil bleibt.
Mit freundlichen Grüssen,
K.-D. Irrgang
BSchmidtB
27.07.2006, 09:55
Guten Tag Frau/Herr (?) Irrgang,
vielen Dank für Ihre ausführliche Stellungnahme zu meinen Fragen.
Sie haben natürlich Recht, es muss Fulvosäuren heißen und ich habe den englischen Begriff unkorrekt ins Deutsche übertragen.
Hauptziel der geplanten Analysen mittels GPC wird sein, die mengenmäßigen Anteile Fulvo- und Huminsäuren in einem Sedimentgefüge zu bestimmen. Das müsste sich doch damit erreichen lassen, oder? Weiteres Ziel ist es, die Huminsäuren nach Molmassen (korrelierend zur Molekülgröße) zu trennen. Dabei ist es nicht vorrangig, möglichst viele Subtypen einzeln zu separieren. Es wird angestrebt in größeren Molnmassenbereichen die mengenmäßige Verteilung zu ermitteln. Auch das müsste sich doch mit GPC realisieren lassen, oder?
Können Sie mir sagen, welche Säulentypen sich bei Ihnen für den Einsatz mit wässrigen Systemen bewährt haben und bei welchen Herstellern ich diese beziehen kann? In welchen preislichen Größenordnungen bewegt man sich bei der Neuanschaffung einer Säule? Wenn Sie schreiben „...kann es gelingen, dass das Material über 1-2 Jahre stabil bleibt.“ ist sicher auch die methodische Erfahrung des Experimentators ein wichtiger Faktor. Als „Neuling“ bei der praktischen Anwendung wird man sicherlich diese maximal möglichen Lebensdauern nicht erreichen. Wären da Lebensdauern bis zu einem Jahr realistisch?
In welchem Bereich nutzen Sie eigentlich die GPC?
Mit freundlichen Grüßen
(Herr) B. Schmidt-Brücken
Guten Tag Herr Schmidt-Brücken,
vielen Dank für Ihre Antwort. Ich möchte mit Ihrer letzten Frage beginnen.
1. Wir isolieren, reinigen und charakterisieren strukturell und funktionell oligomere Pigment-bindende Protein-Kofaktor-Komplexe aus Thylakoidmembranen photoautotropher Organismen, wie Cyanobakterien, Algen und Pflanzen.
Die Gelpermeationschromatographie wird eingesetzt, um a) deren apparente Molmassen zu bestimmen und b) die strukturelle Intakheit der Oligomeren zu testen. Letzteres bezieht sich z. B. auf eine eventuell während der Aufarbeitung auftretende partielle Dissoziation der Oligomere in ihre Untereinheiten.
2. Welche Säulen verwenden wir?
Hier muss man zunächst nach Arbeitstechnik differenzieren:
a. normale LC (bei Normaldruck; liquid chromatography): Sephadex, Sephacel , Sephacryl-Typ-Säulen unterschiedlicher Porenweite
Ziele: Entsalzen von Proben ( Ausschlussgrenze: 10 kDa)
Molmassenbestimmungen von einzelnen Proteinen oder Oligomeren, Abtrennen von kontaminierenden Proteinen (Molmassenbereich: 10 kDa- 3 MDa) (einfache Grundausstattung: Pumpe, Säule, Detektor, Fraktionssammler, Schreiber oder (über ein Interface) Computer .
b. FPLC (fast liquid performance chromatography) (Hochdruck o. Niederdruck) (eine FPLC kostet mehr als 20.000 Euro, je nach Typus und Ausstattung). Säulentypus Superose (mindestens 1500.- Euro).
3. Mengenmäßige Verteilung:
Sie wollen also eine quantitative Verteilung ermitteln.
Das wirft gleich eine wichtige Frage auf: Haben Sie jeweils einen Standard für Fulvo- und Huminsäuren zur Verfügung? Sie brauchen Standards, um eine Kalibrierung vorzunehmen. Gemessen würde dann die relative Absorption als Funktion der Retentionszeit und die Auswertung erfolgte wahrscheinlich über eine Integration der korrespondierenden Flächenpeaks. Überlegen Sie sich ein geeignetes Nachweisverfahren, mit dem Sie die getrennten molekularen Komponenten des Analyten detektieren können, also z. B. mittels Absorption, Fluoreszenz und/oder Leitfäfigkeit etc....
4. Lebensdauer: Hier wage ich keine Prognose, weil dies von zu vielen Unwägbarkeiten abhängt.
Dabei spielen die individuellen Faktoren die größte Rolle. Man sollte auf jeden Fall vor dem Kauf einer Säule prüfen, ob das Säulenmaterial unter den Lösungsmittelbedingungen, unter denen der Analyt gut löslich und beständig ist, auch unverändert bleibt!! Ferner sollte stets nur vollständig gelöster Analyt auf eine Säule aufgetragen werden. Dies ist gegebenfalls vorher durch eine Filtration und durch Zentrifugation der Probe sicherzustellen.
Anbieter und Preise:
Einige Anbieter: Amersham Biosciences; Biorad; Sigma-Aldrich
http://www5.amershambiosciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/ProductsTree
http://www.bio-rad.com/B2B/BioRad/product/br_category.jsp?BV_SessionID=@@@@1480754560.115399 3966@@@@&BV_EngineID=ccchaddigmeihlkcfngcfkmdhkkdflm.0&divName=Life+Science+Research&categoryPath=%2fCatalogs%2fLife+Science+Research%2 fChromatography+%7c+Protein+Purification&loggedIn=false&serviceLevel=Lit+Request&lang=English&country=null&catLevel=3&catOID=-30719&isPA=false
http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Analytical__Chromatography.html
Bei den Preisen ist anzumerken, dass dies natürlich von der Menge des Säulenmaterials und dem Zweck abhängig. Berechnen Sie also vielleicht zunächst einmal die Dimensionen der Säule. Überlegen Sie sich, ob analytisch oder präparativ gearbeitet werden soll. Das bestimmt im Wesentlichen die einzusetzende Säulenmaterialmenge. Der zweite essentielle Faktor ist die Analytmenge bzw. -konzentration . Letzteres bedeutet, das Sie bezogen auf die eingesetzte Menge an Rohmaterial ermitteln, wieviel an Fulvo - und Huminsäure pro g Sediment maximal vorkommt. Im Anschluss muss geprüft werden, wie effektiv ist die Extraktion aus dem Rohmaterial.
Zu guter Letzt vielleicht noch ein Alternativvorschlag: möglicherweise ist die Kapillarelektrophorese eine gute Separationstechnik für Ihre Fragestellung.
Ich hoffe, dass ich Ihnen weitergeholfen habe und verbleibe mit freundlichen Grüssen,
Klaus-D. Irrgang
PS: Ich bin ab Fr. für eine Woche nicht erreichbar.
BSchmidtB
27.07.2006, 14:04
Sehr geehrter Herr Irrgang,
das ist ja eine für mich sehr glückliche Fügung, beim allerersten Versuch gleich an einen derart kompetenten Fachmann zu geraten!
Ich nutze die Gelegenheit, mal schnell noch prinzipielle Unklarheiten meinerseits anzusprechen, bevor Sie dann vorübergehend unerreichbar sind.
Meine Situation ist in sofern etwas ungünstig, weil die ganze Sache schnell erledigt sein muss, ich weder mit GPC oder LC bislang praktische Erfahrung habe und auch keine Zeit ist, im Vorfeld intensivere Tests zu machen. Bin gerade in die Aufgabe eingebunden worden , auf die Schnelle einen Projektantrag zu überarbeiten. Dazu muss ich eben rasch abschätzen, welche Finanzmittel ich für 3 Jahre bei Anwendung dieser Methodik in etwa veranschlagen muss und ob die Methode überhaupt für diese Aufgabenstellung geeignet ist.
1) Wenn ich Ihre Ausführungen richtig verstehe, kann man ohne weiteres die Säulen für die Ausschlussverfahren in herkömmliche Geräte für LC oder FPLC einbauen und nutzen? Oder verstehe ich Sie da falsch? Ich dachte, man müsse da spezielle Geräte nutzen, wie sie bspw. die Firma ANTEC (http://www.antec-gmbh.de/ger_gpc.shtml) anbietet. Dort bekam ich auch die Auskunft, dass Säulen für wässrige Systeme in etwa 8000 Euro kosten.
2) Über einen Standard verfüge ich bisher weder bei den Humin- noch bei den Fulvosäuren. Dass ich einen benötige, war klar. Aber bisher habe ich noch keine Idee, wie ich an so etwas gelangen kann. Könnte man sich eventuell irgendwo Molmassen-Fraktionen besorgen, um daraus Standards herzustellen?
3) Den Analyten in vollständig gelöster Form zu analysieren, ist meine geringste Sorge. Zum einen verfügt unser Institut über Zentrifugen, zum anderen könnte man auch Filtrationen mit Membranfiltern mit Porengrößen bis hinunter zur Sterilfiltration einsetzen.
4) Wann wäre Ihrer Meinung nach der Einsatz präparativer Säulen unumgänglich? Wenn mich meine Kenntnisse aus dem Grundstudium nicht ganz in die Irre führen, setzt man diese dann ein, wenn man größere Mengen der Stoffe eines Gemisches separieren möchte, um sie anschließend für weitere Analysen nutzen zu können. Ein Analysenziel ist ganz sicher zu ermitteln, wieviel an Fulvo - und Huminsäure pro g Sediment enthalten sind.
Vielen Dank für Ihre fachkundigen Ratschläge!!!
Mit freundlichen Grüßen.
B. Schmidt-Brücken
Sehr gehrter Herr Schmidt,
vielen Dank für Ihre schnelle Beantwortung. Um auf Ihre Fragen kurz einzugehen:
ad 1. Sie sprechen ein HPLC-system an. Das von Ihnen genannte lässt sich nicht ohne Weiteres mit den von mir genannten Säulen verbinden. Man muss gegebenfalls mit dem Hersteller abklären, ob er passende Adapter zur Verfügung stellen kann. Ferner muss man prüfen, ob die im ANTEC-HPLC-System herrschenden Druckverhältnisse mit den Säulenmaterialien kompatibel sind.
Es ist richtig, dass HPLC- und FPLC-Systeme spezielle Geräte sind. Man kann nicht ohne Weiteres Geräteteile verschiedener Anbieter kombinieren. Zumeist werden Paketlösungen angeboten. Säulen, die 8000.- Euro kosten sollen, sind entweder präparativer Art oder , falls nicht, völlig überteuert.
ad 2. Wenn es tatsächlich keine Standards geben sollte, was noch einmal durch eine Recherche zu überprüfen wäre, muss man selbst Hand anlegen. Das kann mitunter sehr zeitaufwendig und mühevoll werden.
ad 4. Nach meinen Abschätzungen sind präparative Säulen notwendig, wenn im Gramm-Maßstab gearbeitet werden soll.
Mit freundlichen Grüssen,
K.-D. Irrgang
BSchmidtB
15.08.2006, 13:01
Sehr geehrter Herr Irrgang,
inzwischen konnte ich mich etwas genauer damit beschäftigen, was die genaue Aufgabenstellung beim geplanten Einsatz der SEC angeht. Es geht darum, die löslichen Huminstoffe, also Huminsäuren und Fulvinsäuren bzw. mit ihnen gebildete Metallkomplexe voneinander zu separieren und im Anschluss weitere Analytik mit Blick auf die Ermittlung vorhandener Metalle zu betreiben.
Ich würde um dieses Aufgabe durchzuführen eine Säule benutzen wollen, die sowohl Humin- wie auch Fulvinsäuren durchlässt, die im Nieder-/Mitteldruckbereich arbeitet und eine präparative Trennung ermöglicht. Die Detektion und Trennung der Fraktionen müsste doch eigentlich durch die Änderung von UV-Absorption und/oder Brechungsindex der flüssigen Phase zu ermitteln sein. In der Literatur fand ich bisher als Molgewichtangaben für Fulvinsäuren 0,6-1 kDa und für Huminsäuren 1-10 kDa. Also müsste ich eine Säule mit Ausschlussgrenze von etwa 12-15 kDa wählen.
Sind meine geäußerten Vorstellungen Ihrer Meinung nach richtig oder habe ich grundlegende Fehler darin? Brauche ich bei der Aufgabenstellung trotzdem passende Standards oder ist das nur für eine qunatitative Analyse nötig?
Mit freundlichen Grüßen
Burkhard Schmidt-Brücken
PS: Ich kann mir (hoffentlich) in den nächsten Tagen mal ein im Betrieb befindliches Gerät anschauen. Soweit ich es richtig verstanden habe, wird es dort in der Lebensmittelanalyse eingesetzt, um Rückstände von Toxinen, Spritzmitteln und sonstigen Schadstoffen nachzuweisen.
Sehr geehrter Herr Schmidt,
vielen Dank für Ihre Email. Ich werde auf Ihre Fragen chronologisch eingehen:
1. die zu benutzende Säule soll die Humin- und Fulvinsäuren durchlassen und zugleich eine präparative Trennung ermöglichen.
Dieser Satz ist widersinnig!
Entweder die genannten Substanzen sollen durchlaufen oder separiert werden.
Durchlaufen bedeutet bei der Gelpermeationschromatographie, dass sie sich im Ausschlussvolumen befinden! Daraus folgt unmittelbar, dass sie nicht getrennt worden sind!! Wenn sie also eine präparative Trennung erreichen wollen, müssen sie die Porenweite des Säulenmaterials so wählen, dass eine der beiden Komponenten im Ausschlussvolumen auftritt und die andere in der Säule verbleibt. Alternativ kann man versuchen, dass beide in der Säule verbleiben. Da die Molmassenbereiche der beiden Substanzgruppen entweder nicht weit auseinander liegen oder möglicherweise sogar überlappen - für den Fall, dass niedermolekulare Huminsäuren vorlägen - dürften die Elutionspeaks schlecht getrennt sein. Das bedeutete, dass es Kreuzkontaminationen geben könnte und dann eine Rechromatographie über ein anderes Säulenmaterial notwendig wäre.
2. Ich hatte Ihnen bereits vorgeschlagen, von dem Extrakt eine massenspektrometrische Analyse (z.B mittels MALDI-TOF-MS) vorzunehmen. Dann hat man eine Chance, den Molmassenbereich besser einzugrenzen.
3. Die Dektion der Substanzen sollte mit Hilfe eines UV-Detektors (Wellenlänge n: 180-320 möglich sein.
4. Wenn sie mit Metalllionen komplexierte Fulvin-/Huminsäuren erwarten, könnte es in Abhängigkeit von den gebundenen Ionen auch eine bathochrome Verschiebung der Absorptionsbanden geben oder, dass sogar neue Absorptionsbanden auftreten. Das lässt sich vorher durch Aufnahme eines Absorptionsspektrums im Bereich von 180 - 800 nm testen. Hat man Absorptionen im VIS-Bereich, bräuchte man für die Chromatographie einen VIS-Detektor. Elegant wäre auch ein Dioden-Array-Gerät, mit dem Sie trennen könnten und parallel die Absorptionsspektren aufnähmen.
5. Die Metallionen können ebenfalls vorher mittels Atomabsorptionsspektroskopie (Graphitrohr- o. Flammentechnik) oder - falls Sie Zugang zu einem Gerät haben - mit ICP-MS ( Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry) analysiert werden.
5. Standards würde ich in jedem Fall verwenden.
Mit freundlichen Grüssen,
K.-D. Irrgang
BSchmidtB
18.08.2006, 11:41
Sehr geehrter Herr Irrgang,
vielen Dank für Ihre Antwort. Ich beziehe mich der Übersichtlichkeit halber auf Ihre Nummerierungen.
1. Da hatte ich auf die Schnelle also doch wieder einen Denkfehler drin. Ich hatte fälschlicherweise angenommen, das Ausschlussvolumen würde bedeuten, dass die davon betroffenen Substanzen gar nicht in die Säule hinein gelangen können sondern am Eingang zurück bleiben.
Okay, also bei den Molmassenbereichen 0,6-1,0 kDa (Fluvinsäuren) und 1,0-10,0 kDa (Huminsäuren) bräuchte ich Säulen mit einem Ausschlussvolumen bei 1,0 kDa. Ich vermute auch, dass die Molmassengrenze eher fließend sein wird, es zu Überlagerungen und damit zu Kreuzkontaminationen kommen wird. Zum einen, wenn entsprechend sehr nah benachbarte Molmassen der beiden Substanzklassen auftreten und zum andern auch durch die Metallbindung, die eventuell für eine Gewichtszunahme bei den Molmassen der Fulvinsäuren sorgt, die diese in den Bereich der Huminsäuren hinein schiebt. Wir wissen derzeit nichts über die Zusammensetzung der Sedimente, was die Auswahl der geeigneten Säulen nicht leichter macht.
Bei Ihrer genannten Alternative, das beide Klassen in der Säule verbleiben, müsste aber dann das Ausschlussvolumen doch, wie von mir in der vorhergehenden Nachricht geschrieben, größer als das Molgewicht der Huminsäuren gewählt werden. In dem Falle würden dann beide Substanzklassen verschieden lang vom Flüssigkeitsstrom ausgeschlossen, wenn ich es richtig verstanden habe. Würde in dem Falle die Trennleistung besser als bei der anderen Anordnung oder führt es lediglich dazu, dass sich die Zeitdauer verlängert, weil beide Klassen zurück gehalten werden?
2. Diese spezielle Methode wäre sicher eine gute Hilfe, steht uns aber vermutlich nicht zur Verfügung.
3+4. Dass es zu Verschiebungen der Absorptionsmaxima aufgrund der Metallkomplexierungen kommen wird, hatte ich schon bedacht. Wir haben Zugang zu einem UV/VIS-Spektrometer, mit dem ich das dann konkret prüfen kann. Natürlich nachdem zuvor die im untersuchten Wetland vorhandenen Metalle bestimmt wurden.
5. Ja, es sind ohnehin Analysen mittels ICP-MS geplant. Eventuell kann ich zusätzlich Zugang zu einem AAS-Gerät bekommen.
6. Welche Kriterien müssen die Standards für die GPC im Detail erfüllen?
Mit freundlichen Grüßen
Schmidt-Brücken
Sehr geehrter Herr Schmidt-Brücken,
vielen Dank für Ihre Email. Prinzipiell sollten die Standards folgende Kriterien erfüllen:
1. eindeutig definiert, d.h. ein eindeutig zuordenbare(r) Masse/Massenbereich;
2. von höchstem Reinheitsgrad und bezogen auf die Versuchsbedingungen, vollständig löslich und chemisch stabil;
3. der Massenbereich der zu untersuchenden Analyten sollte innerhalb der Grenzmassen der zur Kalibration benutzten Substanzen liegen.
Das Auschlussvolumen der verwendeten Säule sollte zuvor bestimmt werden, z. B. mit Dextran-Blau.
Im Übrigen, nicht weit von Ihnen - in der Gruppe von B. Hoflack am Biotec Centre der TU Dresden - haben sie vielleicht die Möglichkeit das dort vorhandene ESI-MS- oder MALDI-TOF-MS-Gerät zu benutzen.
Abschließend noch zwei Referenzen: möglicherweise lohnt es sich diese zu lesen.
O´Loughlin et al. (2001) Wat. Res. 35, 333-338
Gilbin et al. (2000) Agronomie 20, 567-576
Ich werde nun für einige Zeit nicht in der Redaktion zur Verfügung stehen.
Mit besten Grüssen
K.-D. Irrgang